av Álvarez-Blázquez1, B., Rodríguez Villanueva2, J.L., Pérez Rial1, E., Peleteiro1, J B., Mylonas3, C.C., Papadaki3, M., Papadakis3 I., Fakriadis3, I., Robles4, R., Linares5, F.

1 Instituto Español de Oceanografía-IEO, Centro Oceanográfico de Vigo, Spanien.

2 Instituto Galego de Formación en Acuicultura-IGAFA, Illa de Arousa, Spanien.

3 Hellenic Center for Marine Research-HCMR, Heraklion, Kreta, Grekland.

4 CTAQUA, Cadiz, Spanien; faktisk anslutning TESTING BLUE S.L., Cádiz, Spanien.

5 Xunta de Galicia, Centro de Investigaciones Mariñas, Vilanova de Arousa, Spanien.

Introduktion

Efter serien av artiklar som publicerats om de fiskarter som ingår i det EU-finansierade DIVERSIFY-projektet (se april, Maj, juni, juli- och oktobernummer av International Aquafeed), som pågick mellan 2013 och 2018, vi presenterar här vrakfisken (Polyprion americanus), som var den mest utmanande arten i projektet.

Vrakfisken är en av de största polyprionidae-arterna, når en storlek på 100 kg. Det är en djupvattensfisk (100-1000m) som finns nästan över hela världen och kännetecknas av en förlängd pelagisk ungfas (Ball et al., 2000; Sedberry et al., 1999). Det är en av de mest intressanta nya arterna för vattenbruk, på grund av dess snabba tillväxt (Suquet &La Pomélie, 2002; Rodriguez-Villanueva et al., 2011), sen reproduktiv mognad, högt marknadspris och begränsade fiskelandningar och enkel hantering i fångenskap utan någon dödlighet registrerad under DIVERSIFY-försöken (Papandroulakis et al., 2008). Dess stora storlek gör den lämplig för bearbetning och utveckling av förädlade produkter, som skulle kunna vara av intresse för EU-marknaden.

Wreckfish accepterar lätt inert mat, att vara en väldigt glupsk köttätare. Vildfångade individer som hölls i fångenskap växte från ett till fem kilo under en period av 10 månader (Rodriguez-Villanueva et al., 2011). Den långsamma reproduktiva mognaden av vrakfiskar, som inträffar vid en ålder av 5-10 år i fångenskap, kan vara ett problem för avelsdjurens utveckling och skötsel. Å andra sidan, dess långa ungdomsstadium är en stor fördel ur vattenbrukssynpunkt, möjliggör kommersialisering före sexuell mognad, och därmed undvika problem kopplade till mognad, såsom minskad tillväxt. Det har visat sig att tillväxten är starkt påverkad av kön och att vrakfiskar är betydligt tyngre än hanar, som observerats i många andra marina fiskarter (Rodríguez, 2017).

Världens vrakfiskbestånd består av tre genetiskt distinkta bestånd:1) Nordatlanten och Medelhavet, 2) Brasilien och 3) södra Stilla havet (Ball et al., 2000). Vrakfisk är en gonokoristisk art utan könsdimorfism och leken förekommer på kontinentalsluttningen på djup av 300-500m, med bildandet av lekaggregat (Peres och Klippel, 2003). Bottenvrakindivider lever på steniga och leriga bottnar, på djup av 40-200m; dock, individer finns ofta i vatten djupare än 300m, med ett maximalt registrerat djup på 1000m (Fischer et al., 1987). Under den första delen av sitt liv (från kläckning till en kroppslängd på cirka 60 cm) är vrakfisken pelagisk och lever tillsammans med flytande skräp.

Arbetet med DIVERSIFY för denna art har fokuserat på områdena reproduktion och genetik, larvikultur och näring, som hittills varit de största flaskhalsarna som förhindrat vrakfiskvattenbruk.

Reproduktion och genetik

Tre lager har upprätthållits vid tre galiciska institutioner (Spanien):Institute of Oceanography (IEO), Ayuntamiento of A Coruña, (MC2) och Conselleria do Mar från Xunta de Galicia (CMRM). Dessutom, ett bestånd upprätthölls vid Hellenic Centre for Marine Research (HCMR) på Kreta, Grekland. Den reproduktiva utvecklingen av dessa bestånd följdes under två år. Reproduktionsperioden (oogenes, mognad och lek) var ganska lång hos vrakfiskar, börjar i oktober och varar ända fram till juli, speciellt i de spanska avelsbestånden som utsatts för lägre temperaturer under året. Den högsta oocytdiametern hos vrakfiskar hittades mellan mars och juli, vilket tyder på att detta är den förväntade lekperioden. Äggstorleken på vrakfiskar (~2 mm i diameter) är markant större än någon annan marin fisk som odlas i de tempererade vattnen vid Europas Atlantkust och Medelhavet (Papadaki et al., 2018). En stor äggstorlek och lägre fruktsamhet anses vara avgörande för demersala fiskar, eftersom det är relaterat till högre individuell överlevnad i en relativt konstant miljö, i motsats till pelagiska små ägg som måste möta en föränderlig miljö, där överlevnaden är svårare och därmed hög fruktsamhet är mer fördelaktig. Embryonal utveckling och tidiga livsstadier har beskrivits (Papandroulakis et al., 2008; Peleteiro et al., 2011), vilket indikerar att den stora äggstorleken hos denna art kan erbjuda betydande fördelar för dess larvuppfödning.

Det är en konstant temperatur på 16°C under hela året (HCMR, Grekland), även om det förmodligen är mer representativt för den miljö som vrakfiskuppfödare utsätts för i de djupa vatten som de lever i naturen, och de verkade inte ha några gynnsamma effekter på den reproduktiva utvecklingen av vrakfiskar i fångenskap. Fisk som hölls under naturligt fluktuerande temperaturer i de spanska bestånden uppvisade samma eller bättre reproduktionsförmåga än fisk under konstanta temperaturer i Grekland, d.v.s. de mognade och lekte spontant. Å andra sidan, män, hålls under konstant temperatur i HCMR-beståndet, förblev i full spermiering under nästan hela övervakningsperioden jämfört med män som exponerades för årliga cykeltemperaturer i Spanien, vilket tyder på att män kanske reagerade annorlunda än kvinnor på de två olika temperaturregimerna i studien.

Spontana leker har erhållits från de tre galiciska bestånden, med ökande regelbundenhet av lekar och gödslingshastigheter allt eftersom projektet fortskred och mer erfarenhet förvärvades. Relativ satsfruktbarhet var också varierande bland de fyra vrakfiskarnas stambestånd i denna studie, varierar mellan 2, 000 och 30, 000 ägg leker-1 kg-1 kroppsvikt. Begränsad ägguppsamling har också uppnåtts från lek i fångenskap efter hormonell induktion och lek i tankar eller manuell strippning av mogna individer. Under det sista året av DIVERSIFY 2018, leken blev mer förenlig med bättre fruktsamhet och befruktning i de spanska avelsbestånden. Baserat på de erhållna resultaten, vi förväntar oss att en fullständig acklimatisering av arten till fångenskap kan resultera i konsekvent naturlig lek och produktion av ägg av god kvalitet.

Leken sker under natten eller mycket tidigt på morgonen (mellan 05:00 och 08:00, med vissa undantag vid middagstid). Under 2017 och 2018, spontan lek hos IEO, MC2- och CMRM-lager producerade ett stort antal befruktade ägg. Lekperiodiciteten var 3-5 dagar i alla bestånd och befruktningsframgången varierade mellan 50 och 100 procent med förbättrad äggkvalitet mot andra halvan av leksäsongen för varje hona. Det har visat sig att en hona kan leka upp till tio gånger per häckningssäsong, medan samma hane har befruktat minst 30 lekar under en total period av 150 dagar.

Honornas svar på behandling med gonadotropinfrisättande hormonagonister (GnRHa) implantat för att inducera lek har varit varierande, med oregelbundna resultat vad gäller fruktsamhet och äggkvalitet. I vissa tillfällen gav tanklek eller strippad spawn icke-livsdugliga ägg, och vid andra tillfällen även om befruktningen var en framgång, kläckningen var noll. Konstgjord lek genom strippning kan vara den valda metoden med mogna honor som uppvisar problem att leka spontant efter GnRHa-induktion. När det gäller honor som genomgår oocytmognad naturligt (utan exogena hormoner) är det inte tillrådligt att använda strippning, eftersom stressen som orsakas av manipulationerna kan resultera i dålig äggkvalitet och bristande befruktningsframgång.

När det gäller de manliga egenskaperna, könsmognad äger rum från mars till juli som för honor, nå sin topp under april och juni. Alla studerade spermiekvalitetsparametrar varierade signifikant under studiens två år, men utan någon tydlig korrelation med den kvinnliga häckningssäsongen (mars-juni). Övergripande, spermiekvaliteten ansågs vara hög under hela året. Genomsnittlig spermiedensitet varierade mellan 4,5-11,5 x 109 spermier ml-1, spermiemotiliteten var alltid högre än 60 procent, varaktigheten av rörligheten varierade mellan 1,5 och 6 minuter och överlevnaden av spermier vid 4°C varierade mellan 3 och 10 dagar, även om i vissa fall en överlevnad på 18 dagar uppnåddes (Pérez Rial, 2019). Spermiedensiteten var mycket lik andra pelagiska arter, som europeisk havsabborre (Dicentrarchus labrax), guldbraxen (Sparus aurata) eller mager (Argyrosomus regius). Dock, koncentrationen av vrakspermier är högre än den som finns i tunga (Solea solea) och piggvar (Scophthalmus maximus).

Det finns tre möjliga procedurer för att få vrakfiskar som leker i fångenskap:

1. Utsätt uppfödare för naturliga fototermiska förhållanden i stora tankar (>40 m3) och få spontana lekar
2. Framkalla lek med hormonimplantat laddade med GnRHa, om fisken inte genomgår ägglossning och leker spontant, och låt fisken leka i tankarna
3. Framkalla mognad och ägglossning genom hormonbehandling, och strippa-lek äggen följt av provrörsbefruktning.

Trots den enkla hanteringen av denna art i fångenskap, dess stora storlek kräver stora tankar för att garantera dess välbefinnande och undvika stressinducerade reproduktiva dysfunktioner, som skulle påverka gametogenes och mognad. Även om det är möjligt att avskaffa vrakfiskar och befrukta äggen in vitro efter hormonell induktion av ägglossning är den frekventa hanteringen av honorna problematisk när man har att göra med så stora fiskar. Under projektets gång, det har visat sig att vrakfiskar kan föröka sig spontant med mycket goda resultat i äggfruktbarhet och befruktning, och detta är den rekommenderade metoden för reproduktion med tanke på industriell vattenbruksproduktion av denna art.

Reproduktion och larvuppfödning av en mycket nära art, hapuku (Polyprion oxygeneios) har uppnåtts först nyligen i Nya Zeeland (Anderson et al., 2012; Symonds et al., 2014; Wylie et al., 2018). Bristen på avelsdjur är en nackdel för vrakfiskkulturen, men den tydliga biologiska och ekonomiska potentialen hos denna art motiverade tilldelningen av en del av DIVERSIFY:s ansträngningar för att sammanföra nästan alla europeiska partner som hittills varit involverade i tämjandet av vrakfisk, för att övervinna dess dokumenterade flaskhalsar -- dvs. reproduktion och larvuppfödning-- för att producera lämpligt antal ungar för att starta kommersiell produktion.

Larvikultur

Under de första stadierna av äggutvecklingen, sårbarheten för yttre förhållanden är högst. Optimal inkubationstemperatur och larvkulturförhållanden har justerats i IEO:s anläggningar för att få en korrekt embryonal utveckling (Álvarez-Blázquez et al., 2016). Zootekniska aspekter som luftning, tankens hydrodynamik och vattenflöde har optimerats. Dessa är viktiga parametrar för att minska larvmissbildning, vilket är en fråga som skulle behöva utredas ytterligare. Under försök med vrakfisklarvodling i DIVERSIFY, missbildningar hittades som kan likna ett syndrom som är relaterat till konsumtionen av gulesäcken (SYSS) som beskrivs av Gunakesera et al (1998) eller även till "blåsäckssjukdomen" (BSD) som beskrivs för vanlig öring. Ytterligare studier kommer att vara nödvändiga för att identifiera detta problem.

I vrakfiskar, ontogenesen av matsmältningssystemet anses vara en långsam procedur jämfört med andra arter. Utvecklingen av matsmältningssystemet styrs av endogena faktorer och är i allmänhet genetiskt programmerad, men tiden för uppkomsten av strukturerna i matsmältningssystemet kan påverkas av en rad exogena faktorer, med temperatur som en av de viktigaste (Kamler, 2002). Dessutom, det visade sig att näthinnans ontogeni liknar det allmänna mönstret för de flesta fiskarter. Vid kläckning, näthinnan är en odifferentierad och icke-funktionell vävnad, som förekommer hos de flesta marina fiskar med pelagiska stadier av tidiga liv (Pankhurst och Eagar, 1996; Pankhurst och Hilder, 1998; Pankhurst et al., 2002; Roo et al., 1999; Shand et al., 1999). Konceller var de första fotoreceptorerna som dök upp (6 dph). Detta faktum indikerar att fiskar efter 5 dph kan identifiera mat såsom hjuldjur och Artemia nauplii.

Inom DIVERSIFY-prövningarna, larvkläckningen varierade mellan 42 och 82 procent, vilket kan anses mycket acceptabelt. Dock, larvernas överlevnad har varit ganska begränsad. Endast under projektets sista år, det har varit möjligt att få tag i några larver som framgångsrikt har avvänjts och unga djur har erhållits och odlats vid IGAFA:s (Galician Institute of Aquaculture, Galician Institute of Aquaculture, Spanien), som är en CMRM-samarbetsorganisation. Detta var första gången i projektet som vi lyckades producera ungfisk som avvandats till inert mat, och det är en milstolpe i ansträngningarna att producera vrakfisk under vattenbruksförhållanden. Detta försök har gett viktiga data om vrakfiskars tillväxt och har ökat vår kunskap om utfodringsprotokollet och det specifika beteendet och metamorfosen hos vrakfisklarver (Rodríguez et al, 2019).

Under projektets sista år, ett stort antal experimentella försök utfördes i larvkultur, fokuserat på att anpassa olika kultursystem (flöde genom, mesokosmos och recirkulerande vattenbrukssystem, RAS) och miljöparametrar som vattentemperatur, odlingsvolym, larvdensitet, matsekvens, luft, ljus, form och färg på tankarna.

De bästa resultaten uppnåddes med RAS på IGAFA-anläggningarna med två satser larver från IEO- och MC2-lek. Maten var baserad på hjuldjur, Artemia nauplii och berikade metanauplii. Båda satserna av larverna nådde avvänjningsperioden och befinner sig för närvarande i juvenil fas. Detta är första gången som ett parti vrakfiskungar producerades under odlingsförhållanden och representerar en milstolpe i våra ansträngningar att göra denna art till en fast kandidat för exploatering i industriell skala.

Huvudresultaten från det experimentella arbetet med vrakfisklarvodling i DIVERSIFY-projektet har publicerats (Pérez Rial et el., 2019) och kan sammanfattas enligt följande:

• Ontogenesen av organen relaterade till matsmältningssystemet och synsystemet fullbordades inte förrän dag 23 efter kläckningen. De flesta av organen (förutom käktänderna i överkäken som blev synliga vid 19 dph), visades med 8 dph
• Den optimala temperaturen för ägginkubation ligger i intervallet 16,5-19,5ºC. Lägre temperaturer (14±0,5ºC) främjar högre larvdeformiteter och låga kläckningshastigheter, med högre dödlighet under de tre första dagarna av inkubationen. Larvkulturens temperatur mellan 16-18ºC är tillräcklig för bättre överlevnad och tillväxt
• De nykläckta larverna kännetecknas av sin stora gulesäck, lagring av endogena reserver till dag 20 dph vid 17±0,5ºC. Den stora gulesäcken och den långsamma absorptionen av lipiddroppen indikerar en lång period av autotrofisk näring
• En larvmatningssekvens definierades i recirkulationssystemet som gav bra resultat vid en temperatur på 17,5-18ºC, med en naturlig fotoperiod från 7-9 dph. Utfodring av levande föda:hjuldjur berikad med ett arakidonsyra (ARA)-tillskott från 8-19 dph, Artemia nauplii från 15 till 23 dph och Artemia metanauplii från 18 till 48 dph. Inert mat administrerades från 40 dph och framåt
• Inkubations- och larvodlingsteknologierna anpassades till kraven för denna art och viktiga resultat uppnåddes med larvkulturen i RAS (Rodríguez et el., 2019)

Näring

Näringsbehovet för vrakfiskar var okända hittills och det fanns bara ett fåtal referenser relaterade till utfodringsmiljöer från kommersiell fångst (Brick Peres &Haimovi, 2003) och utfodringshastigheter i fångenskap (Papandroulakis et al., 2004). Nyligen gjordes några studier på sammansättningen av vilda vrakfiskar (Roncarati et al., 2014; Linares et al., 2015) och deras morfometriska egenskaper (Álvarez-Blázquez et al., 2015). Den optimala utvecklingen av avelsfoder för vrakfisk är avgörande för framtiden för dess vattenbruk. Fetter i kosten och särskilt fettsyror spelar en avgörande roll för framgångsrik produktion av högkvalitativa könsceller och ägg från havsfisk (Izquierdo et al., 2001; Sargent et al., 2002). Också, utvecklingen av berikningsprodukter av levande bytesdjur är mycket viktig för framgången i larvkulturen. Förståelsen av kraven på fleromättade fettsyror (PUFA) hos marina fisklarver kräver definitionen av optimalt dietförhållande av DHA, EPA och ARA.

Baserat på data från biokemiska analyser av gonader från vilda vrakfiskhonor, ägg och larver från uppfödda fiskar, vissa produkter för anrikning av levande foder har utvecklats för larvvrakfiskar. Vissa näringsexperiment med vrakfisklarver utfördes i DIVERSIFY som visar att larver uppvisar, i allmänhet, en god acceptans av det anrikade levande bytet som testades och inga skillnader i fettsyrasammansättningen hos vrakfisklarver som matades med bytet berikade med de testade anrikningsprodukterna hittades vid olika levnadsdagar. Fettsyraprofilen hos vrakfisklarver längs larvutvecklingen visar stora mängder PUFA, speciellt DHA, EPA och ARA. Vidare, det finns ett tydligt samband mellan fettsyraprofilen hos avelsfoder som tillhandahålls och fettsyraprofilen för oocyter och ägg (Linares et al., 2016, 2018)

Resultaten som erhölls angående sammansättningen av vävnader från vilda exemplar var mycket användbara för att öka kunskapen om näringsbehoven för denna art, som visar en stor mängd proteiner och en låg nivå av lipider i muskeln. Dessutom, resultaten tyder på att det berikade levande bytet som används som föda för larverna är väl smält. Även om än så länge, larverna har en mycket låg överlevnadsgrad, resultaten 2018, med erhållandet av de första ungarna, är mycket lovande.

Det är helt uppenbart att denna art uppvisar en snabb tillväxthastighet och en enkel anpassning till fångenskapsmiljön och hanteringsprocedurer. Låga utfodringshastigheter registrerades under lekperioden (från mars till juli) och höga utfodringshastigheter inträffade under hösten. Förtäringsgraden varierade mellan 0,2 och 0,5 procent för fisk som utfodrats med halvfuktig diet, och mellan 1 och 1,8 procent för de som matades med torr pellets (Pérez Rial, 2019). Resultaten som erhållits under DIVERSIFY-projektet när det gäller nutrition kan sammanfattas i följande punkter:

Vrakfiskar har en stor mängd proteiner i musklerna (84 % hos vild fisk och 78 % hos uppfödd fisk) och nivån av lipider är lägre i muskeln från vild fisk (7 % DW) än hos uppfödd fisk (25 %). Angående fettsyrasammansättningen i muskler, värdena för PUFA och ∑n-3 är högre hos vilda vrakfiskar (39 respektive 34 % av de totala fettsyrorna) än hos uppfödd fisk (30 och 24 %). DHA-värden representerar 12 procent i odlad fisk och 26 procent i vild fisk. EPA-halten representerar sett procent i uppfödd fisk och fyra procent i vild fisk och ARA 1,6 procent och 3,1 procent i uppfödd respektive vild fisk. EPA/ARA-förhållandet har värden på 4,6 i uppfödd fisk och 1,5 i vild fisk (Linares et al, 2015).

Betydande framsteg gjordes i kunskapen om denna art när det gäller dess biologi, näring, reproduktion och fysiologi, såväl som dess anpassning till fångenskap, reproduktionsteknik och larvkultur och den första kunskapen om dess larverontogeni tillhandahölls. De erhållna resultaten samt bristen på exemplar i den naturliga miljön, är två aspekter av stor betydelse för att fortsätta ägna forskningsinsatser för utveckling av vattenbruk för denna art. Den anses vara en art med hög potential med tanke på diversifieringen av industriellt vattenbruk. Att ha lyckats få tag i ungfisk i fångenskap har genererat en stor inverkan i vattenbrukssektorn, intresserad av att diversifiera och förnya sig. Det allmänna intresset för vetenskapliga framsteg inom odling är stort, och särskilt av de företag som för närvarande har lager av mogna exemplar av denna art (främst i Spanien).