av Constantinos C Mylonas, Projektkoordinator (HCMR, Greee), Birgitta Norberg, Reproduktion och genetik - Atlantic Hellebut Leader (IMR, Norge), Kristin Hamre, Nutrition - Atlantisk hälleflundraledare (NIFES/IMR, Norge), Torstein Harboe, Larvuppfödning - Atlantisk hälleflundraledare (IMR, Norge), Sonal Patel, Fish Health - ledare för atlantisk hälleflundra (IMR, Norge; för närvarande på VAXXINOVA, Norge) och Rocio Robles, Spridningsledare (CTAQUA, Spanien)
En av arterna som ingår i det EU-finansierade DIVERSIFY-projektet, som sprang mellan 2013 och 2018 var hälleflundran (Hippoglossus hippoglossus). Hälleflundran är världens största plattfisk och kan nå en vikt på över 300 kg. Det är mycket uppskattat på marknader över hela världen, men tillgången på vild hälleflundra minskar.
Norska bestånd klassificeras som livskraftiga, men fisket är föremål för strikt reglering. Detta har lett till en högre efterfrågan på hälleflundra på marknaden, som inte enbart kan tillgodoses av fiske.
Hälleflundran (se figur 1) är en halvfet fisk, rik på omega-3 fettsyror, med ett karaktäristiskt flagigt vitt kött med få ben. Odlad atlantisk hälleflundra har ett utmärkt rykte och marknadsförs traditionellt som stora fiskbiffar eller kotletter. Den kan rökas eller marineras i typisk skandinavisk stil. Dessa egenskaper ledde till att hälleflundra inkluderades i DIVERSIFY, som en stor kandidat för fiskarter och produktdiversifiering inom europeiskt vattenbruk.
Forskning och odling av hälleflundra startade på 1980-talet, och även om den totala årliga produktionen av odlad hälleflundra ökar, den nådde fortfarande bara ~1600 ton 2017 (Norska Fiskeridirektoratet).
I Europa, Atlantiska hälleflundror finns i Norge och Skottland. Önskad marknadsstorlek är 5-10 kg och produktionstiden är för närvarande fyra till fem år. Trots en betydande forskningsinsats mellan 1985 och 2000, hälleflundrans komplicerade livscykel gjorde att vattenbruket gick långsamt, och mycket lite forskningsmedel har tilldelats därefter.
Dock, under denna tid har långsamma men stadiga framsteg gjorts av bönderna för att förbättra produktionsstabiliteten, och intresset för både bur- och landbaserad kultur växer. De återstående flaskhalsarna för ökad och stabil produktion är relaterade till en stadig tillgång på yngel och ett behov av att minska produktionstiden.
Det senare kan uppnås med den nyligen genomförda etableringen av "all kvinnlig" ungproduktion. Detta förväntas ha stor inverkan på produktionstiden eftersom honorna växer snabbare och mognar senare – 80 procent av slaktad fisk <5 kg är mogna hanar.
Projektet DIVERSIFY åtgärdade dessa viktiga flaskhalsar med en samordnad forskningsinsats inom reproduktion, larvnäring och skötsel och vaccinutveckling. Kombinationen av biologiska, tekniska och socioekonomiska forskningsaktiviteter som utvecklats i DIVERSIFY förväntas stödja diversifieringen av EU:s vattenbruksindustri och hjälpa till att utöka produktionen, ökade vattenbruksprodukter och utveckling av nya marknader.
Fortplantning
Forskning i vårt projekt bekräftade att vildfångade honor lekte tillförlitligt och producerade konsekvent ägg av mycket hög kvalitet (>85 % befruktning). Odlade honor producerade också ägg av hög kvalitet när deras ägglossningscykler identifierades, och strippning utfördes nära ägglossningen (se figur 2).
För kommersiell produktion, samt avelsändamål, det är inte praktiskt att lita på vildfångade honor. Dock, relativt få odlade honor producerade ägg konsekvent med befruktningsgrader>80-85 procent. Som en konsekvens, det kan bli nödvändigt att inkludera vildfångade avelsdjur även i framtida avelsgrupper för att säkerställa ett tillräckligt brett genetiskt material.
Plasmakoncentrationer av könssteroider hos odlade uppfödare liknade vad som tidigare rapporterats i hälleflundra, med årliga profiler efter äggstockstillväxt och mognad. De högsta nivåerna av 17β-östradiol (E2) registrerades strax före lek, i början av februari, medan både E2 och testosteron (T) förblev förhöjda under lekperioden.
Inga skillnader i genomsnittliga koncentrationer sågs mellan vildfångade och odlade honor. Plasmakoncentrationer av gonadotropinerna follikelstimulerande hormon (FSH) och luteiniserande hormon (LH) dokumenterades för första gången i atlantisk hälleflundra.
Genomsnittliga FSH-koncentrationer var relativt stabila under vitellogenes, från oktober till början av februari, överensstämmer med en konstitutiv frisättning av FSH från hypofysen. Plasma-FSH minskade till låga nivåer under leken men ökade igen efter att leken avslutats.
Plasma-LH-koncentrationer visade stora individuella variationer genom reproduktionscykeln, men höga nivåer upptäcktes under leken. Detta överensstämde med tidigare rapporterade resultat i andra teleostar, inklusive ett antal plattfiskar.
Implantation med gonadotropinfrisättande hormonagonist (GnRHa) förlängde inte lektiden signifikant hos hälleflundrahonor, men en uppenbar synkronisering i lektid mellan individer sågs, som behandlade honor hade avslutat leken en månad innan kontrollfisken tillbringades. I kommersiell produktion, synkronisering mellan individer kan vara en fördel då personalens insatser vid ägginsamling kan koncentreras till en relativt kort period (se figur 3).
Uppfödare av hälleflundra måste övervakas för ägglossning och avskalas regelbundet, och ägg befruktas in vitro. Därför, Användningen av GnRHa-implantation erbjuder en logistisk fördel för den kommersiella avelshanteringen av arten, genom att minska leksäsongen.
Näring
För utveckling av ett protokoll för tidig avvänjning av hälleflundralarver, vi fann en stor skillnad vad gäller larvernas foderintag på tre olika kommersiella dieter 28 dagar efter första utfodring (dpff) (se figur 4).
Larver som matades med den kommersiella marina larvdieten Otohime (Japan) hade fulla tarmar efter fem dagars utfodring. Denna diet användes i ett experiment som syftade till att hitta den tidigaste tidpunkten för avvänjning vid 15, 22 och 28 dpff. Avvänjning vid 15 dpff resulterade i nästan 100 procent dödlighet, vid 22 dpff cirka 30 procent dödlighet och vid 28 dpff, nästan noll procent dödlighet.
Slutsatsen var att dietens egenskaper är viktiga för att säkerställa foderintaget hos hälleflundralarver och att larverna är redo att livnära sig på ett formulerat foder endast vid 28 dpff. Ytterligare experiment behövs för att utvärdera om de tidiga larverna växer och utvecklas bra på dessa dieter.
Också, ett protokoll för produktion av påväxt Artemia utvecklades och näringssammansättningen analyserades. Artemia odlas i tre dagar på odlingsmediet ORI-kultur (Skretting, Spanien) och sedan berikad med mediet LARVIVA Multigain (Biomar, Danmark) fick en förbättrad näringsprofil i många aspekter.
Proteinet, ökat innehåll av fria aminosyror och taurin, minskade lipider och glykogen, medan förhållandet mellan fosfolipider (PL) och totala lipider (TL) ökade. Fettsyrasammansättningen förbättrades vid ett experiment, men inte vid den som utförs hos den kommersiella partnern. Mikronäringsprofilerna påverkades inte negativt av odling av Artemia på ORI-odlingsmediet.
Eftersom tidigare forskning hade funnit att larver som matades på odlad Artemia utvecklades till ungdjur med bättre kvalitet, larver matades på växt Artemia jämfört med konventionell Artemia nauplii i DIVERSIFY (se figur 5).
Det fanns inga skillnader i tillväxt, pigmentering eller ögonvandring mellan de två grupperna och larvernas näringssammansättning efter tre veckors utfodring var mycket lika. Slutsatsen var att Artemia nauplii producerad med moderna metoder har tillräckliga näringsnivåer för att täcka behoven hos hälleflundralarver.
Också, hypotesen att larver som föds upp i återcirkulerande vattenbrukssystem (RAS) skulle ha en annan mikroflora i tarmen och, därför, har olika upptag av näringsämnen undersöktes. Dock, förutom högre nivåer av vitamin K-derivatet MK6, vi fann inga skillnader i näringsutnyttjande mellan larver som föds upp i RAS eller flödessystem.
Till sist, Unga hälleflundror (ett gram kroppsvikt) matades med dieter med fem PL-nivåer som varierade från 9 till 32 procent av TL. Det fanns inga effekter av PL-nivåer på tillväxt eller lipidsammansättning i tarmen, lever och muskler, 24 timmar efter utfodring.
Dock, tid efter måltiden påverkade lipidsammansättningen i tarmvävnaden, med högre nivåer av neutrala lipider en och fyra timmar efter måltiden, och högre nivåer av polära lipider, kolesterolestrar och ceramid 24 timmar efter måltiden, reflekterar absorptionen av lipiderna tidigt efter måltiden.
Det verkar som om unga hälleflundror reglerar sin lipidartsammansättning så att den är oberoende av kosten när en rad PL/triacylglycerol appliceras, som i föreliggande studie (se figur 6).
Larvskötsel
Ett protokoll för odling av Artemia nauplii utvecklades och beskrevs. Användning av påväxt Artemia under den kritiska perioden av metamorfos i atlantisk hälleflundralarver skilde sig inte från användningen av Artemia nauplii med avseende på tillväxt, dödlighet och yngelkvalitet. Dessutom, produktionen av påväxt Artemia var arbetskrävande, och höga personalkostnader kan vara oöverkomliga vid implementering av denna levande foderkälla i kommersiell larvuppfödning.
Den kommersiella produktionen av hälleflundrayngel sker för närvarande i flödessystem (FT), medan det finns en växande konsensus om att en RAS skulle erbjuda mer stabila miljömässiga och kemiska vattenparametrar som skulle leda till förbättrad larverprestanda.
Produktionsprotokoll för gulesäck och larver med första matning i RAS utvecklades i DIVERSIFY. Inga skillnader i överlevnad upptäcktes mellan RAS- och FT-uppfödning under gulesäcksinkubation. När systemen förbereddes under en månad, larvtillväxten var signifikant högre i RAS-gruppen under den första utfodringen. Hög dödlighet inträffade i en av FT-tankarna.
Tagen tillsammans, resultat tydde på att med adekvat konditionering av RAS, ett stabilt system etableras där tillväxt och överlevnad av larver är så god som, eller bättre än i FT-system med optimala förhållanden. RAS var ett mer stabilt uppfödningssystem för hälleflundralarver jämfört med FT-systemet.
Metagenomisk karakterisering av bakteriesamhällena i uppfödningsvatten och larver visade att minst 300-400 olika bakteriesläkten fanns i uppfödningssystemen. Signifikanta skillnader upptäcktes i mikrobiotasammansättningen av RAS- och FT-systemen:både i silos och tankar, och i vattnet och larverna.
Ingen tydlig korrelation sågs mellan mikrobiotan i vattnet och larvernas mikrobiota. Karakterisering av mikrobiotasammansättningen ger viktig information för utveckling av probiotisk behandling av hälleflundralarver.
Fiskens hälsa
För att utveckla ett vaccin mot viral neural nekros för atlantisk hälleflundra larver, kapsidproteinet från Nodavirus uttrycktes framgångsrikt rekombinant i tre olika system; E coli, Leishmania tarentolae och i tobaksväxt, och som förväntat var det variation i mängden uttryck mellan systemen.
Dessutom, det rekombinanta kapsidproteinet uttryckt i Pichia tillhandahölls från EU-projektet TARGETFISH. Dessa fyra uttryckssystem skiljer sig åt i hur de uttryckta proteinerna glykosyleras efter translation. Genom att konstruera och använda E. coli och Leishmania tarentolea som uttrycker grönt fluorescerande protein (GFP), det kunde visualiseras med fluorescensmikroskopi att Artemia filtrerade effektivt och fick i sig dessa mikrober, och därigenom det rekombinanta proteinet.
Artemia intog rekombinant Nodavirus kapsidprotein uttryckt av de olika systemen, vilket kunde bekräftas genom immunoblotting.
Det rekombinanta kapsidproteinet uttryckt av det olika systemet matades sedan till Artemia, som matades till hälleflundralarver vid 100 dph. Tio veckor senare, ungdomarna i alla behandlingsgrupper utmanades av en i.p. injektion (se figur 7) med Nodavirus för att kontrollera effektiviteten.
Den utmanade fisken avslutades åtta veckor efter utmaningen och testades med avseende på närvaron av Nodavirus i hjärnan genom realtids-RT-PCR riktad mot det virala RNA2-segmentet. Ingen signifikant skillnad kunde ses mellan de olika behandlingsgrupperna, inklusive gruppen med rekombinant protein som har visat skydd tidigare.
Detta tyder på att fiskens storlek och behovet av att sortera fisk för att minimera enorm variation mellan individer i olika faser vid vaccinationstillfället har sina inneboende begränsningar och bör övervägas noggrant.
Sammanfattningsvis, även om det har visat sig att Artemia kommer att ta upp och ackumulera de olika formerna av rekombinanta Nodavirus-kapsidproteiner och fungera som en vektor för oral leverans till larver av hälleflundra, utmaningsexperimenten indikerar att denna strategi för antigenleverans inte inducerar skydd mot Nodavirusinfektion, åtminstone under de förhållanden som används i denna studie.
En teknisk produktionsmanual har tagits fram för hälleflundra och kan laddas ner från projektets hemsida www.diversifyfish.eu.
Detta 5 år långa projekt (2013-2018) har fått finansiering från Europeiska unionens sjunde ramprogram för forskning, teknisk utveckling och demonstration (KBBE-2013-07 enstegs, GA 603121, DIVERSIFIERA).
Konsortiet omfattar 38 partners från 12 europeiska länder – inklusive nio små och medelstora företag, två stora företag, fem yrkesorganisationer och en konsument-NGO- och samordnades av Hellenic Centre for Marine Research, Grekland.
