Vävnadskulturtekniker

Vävnadskulturtekniker i växter, Procedur för vävnadskultur och vävnadskulturutveckling Setup Lån.

Introduktion:

Vad är vävnadskultur? Vävnadskultur är odling av en växt under användning av en stickling eller annan växtvävnad. Vävnadsodling är den vanligaste formen av växtreproduktion och kloning i växthusmiljö. Vävnadskultur kan användas för att reproducera växter som uppvisar exceptionell sjukdomsresistens, eller någon annan önskad egenskap. Den odlade vävnaden kan bestå av en enda cell, en population av celler, och en del av en orgel. Celler i kultur kan föröka sig; ändra storlek, form, uppvisa specialiserad aktivitet; eller interagerar med andra celler.

Vävnadsodlingstekniker används ofta för kommersiell tillverkning av växter såväl som för växtforskning. Vävnadskultur involverar användning av små bitar av växtvävnad, som odlas i ett näringsmedium under sterila förhållanden. Använd lämpliga odlingsförhållanden för varje explantattyp, växter kan förmås att snabbt skapa nya skott, och, med tillägg av ordentliga hormoner nya rötter. Dessa plantor kan delas, att producera ett stort antal nya plantor. De nya plantorna kan sedan placeras i jord &odlas på vanligt sätt. Vävnadskulturmedia , det är en grupp system som används för att odla växtceller, vävnader eller organ under sterila förhållanden på ett näringsodlingsmedium av den kända sammansättningen. Växtvävnadskultur används i stor utsträckning för att generera kloner av en växt i en metod som kallas mikroförökning.

Betydelsen av vävnadsodling:

• På relativt kort tid och utrymme, ett stort antal plantor kan produceras med utgångspunkt från det enda explantatet.
• Att ta ett explantat förstör i allmänhet inte moderplantan, så sällsynta och hotade växter kan klonas säkert.
• Det är lätt att välja önskvärda egenskaper direkt från odlingsuppsättningen (in vitro) och därigenom minska mängden utrymme som behövs, för fältförsök.
• När väl etablerat, en vävnadsodlingslinje kan ge en kontinuerlig tillförsel av unga plantor under hela året.
• Den tid som krävs är mycket förkortad, ingen vill vänta på hela livscykeln av fröutveckling. För arter som har långa generationstider, lågt stadium av fröproduktion, eller frön som lätt inte gror, snabb spridning är möjlig.
• In vitro-odlande växter är vanligtvis fria, från bakteriella och svampsjukdomar. Virusutrotning och underhåll av växter i virusfritt tillstånd. Detta underlättar anläggningens utveckling över internationella gränser.
• Växtvävnadskulturbanker kan frysas och sedan regenereras genom vävnadsodling. Det bevarar pollen- och cellsamlingarna från vilka växter kan förökas.

Typer av vävnadskultur:

Frökultur

Frökultur är den typ av vävnadskultur som främst används för växter som orkidéer. För denna metod, explantat erhålls från en in vitro-härledd växt och introduceras i en artificiell miljö, där de kan föröka sig.

Embryokultur

Embryokultur är den typ av vävnadskultur som involverar isolering av ett embryo från en känd organism för in vitro-tillväxt. Embryokultur kan uppta användningen av ett moget eller omoget embryo. Medan mogna embryon i kultur huvudsakligen erhålls från mogna frön, innebär användning av omogna embryon från hybridfrön som inte lyckades gro. Genom att göra så, embryot kan i slutändan skapa en livskraftig växt. För embryokultur, ägglosset, frön från vilket embryot ska erhållas steriliseras, och embryot behöver inte steriliseras igen. Salt sackaros kan användas för att ge embryot näringsämnen. Embryokulturen är berikad med organiska eller oorganiska föreningar, oorganiska salter såväl som tillväxtreglerande medel.

Callus kultur

Calluskultur bildas genom proliferation av modervävnaden. Cellerna i en kallus är parenkymatösa, amorf &oorganiserad. Rent generellt, kalluskultur bildas som ett resultat av en skada vid de avskurna ändarna av en stam eller en rot. Ett lokaliserat aktivitetscentrum registreras i en kallus.

Organkultur:

Det kan möjliggöra differentiering och bevarande av arkitekturen. Organkulturen hänvisar till in vitro-odling och underhåll av ett utskuret organ, ur eller helt eller delar av ett organ i sättet och funktionen.

Anther kultur

Androgenes är in vitro-utvecklingen av haploida växter som kommer från potenta pollenkorn genom en serie av celldelning och differentiering.

Somatisk embryogenes

Detta är processen för en enda eller grupp av celler som initierar tillväxtvägen som leder till reproducerbar regenerering av monozygotiska embryon som kan gro och bilda kompletta växter.

Bearbetning av odlade celler och vävnader:

Levande kulturer kan undersökas direkt med ett mikroskop, eller så kan de observeras med hjälp av fotografier och filmer tagna genom mikroskop. Celler, vävnader, och organ kan dödas, fast, och färgade för vidare undersökning. Efter fixering, prover kan bäddas in och skäras i tunna sektioner för att avslöja ytterligare detaljer under ett ljus- eller elektronmikroskop.

Celler i växtvävnadskultur utsätts för ett brett spektrum av experimentell behandling. Till exempel, virus, läkemedel, vitaminer, sjukdomsalstrande mikroorganismer kan sättas till kulturen. Forskare observerar sedan cellerna, letar efter globala förändringar i cellbeteende för förändringar i specifika molekyler, såsom förändringar i uttrycket av ett visst protein.

Biologiska insikter:

Växtvävnadsodling har möjliggjort många upptäckter inom biologiska vetenskaper. Det har avslöjat, grundläggande information om celler angående deras sammansättning och form; deras biokemiska, genetisk, och reproduktiv aktivitet; och deras näring, ämnesomsättning, specialiserade funktioner. Det är också processer för åldrande och läkning; effekterna på celler av fysiska, kemisk, och biologiska medel; och skillnaderna mellan normala celler och onormala celler, såsom cancerceller. Arbete med växtvävnadskulturer har hjälpt till att känna igen infektioner, och kromosomavvikelser, att kategorisera tumörer, och att formulera och testa läkemedel och vacciner.

Sedan upptäckten att vissa virus växer i vävnadskultur, Tekniken har använts för att producera vacciner mot poliomyelit, mässling, påssjuka, och andra infektionssjukdomar. Cellkulturer har producerat virala hämmare, inklusive interferon. Hormoner produceras från kulturer av celler eller organ. Odlade vita blodkroppar från två individer kan användas för att fastställa kompatibilitet mellan potentiella donatorer och mottagare av vävnadstransplantationer.

De viktigaste stegen i växtvävnadskulturen:

Initieringsfas:

Initieringsfasen är den första delen av växtvävnadsodling. Här, vävnaden av intresse erhålls och steriliseras för att förhindra att någon mikroorganism påverkar processen negativt. Det är under denna fas som vävnaden initieras in i kulturen.

Multiplikationsfas:

Multiplikationsfasen är det andra steget av vävnadsodling där växtmaterialet in vitro delas om och sedan introduceras i mediet. Här, mediet är sammansatt av lämpliga komponenter för tillväxt, inklusive regulatorer och näringsämnen. Dessa är ansvariga för spridningen av vävnaden och skapandet av flera skott.

Förlängning:

Växter överförs igen, i laminärt flödeshuven, på ett medium som gör att skotten förlängs. Detta är det stadium där växternas stjälkar växer i längd och börjar likna små växter.

Rotbildning:

Det är i detta skede som rötter bildas. Här, hormoner krävs för att framkalla rotbildning, &följaktligen kompletta plantor. Detta kan inträffa i vävnadsodlingsarbetet i växthuset, beroende på art. De långsträckta skotten klipps bort från basvävnaden och placeras på media som innehåller auxiner, för rotning. När rötter väl är synliga, växterna kan planteras in i växthuset. Växter som kommer från labbmiljön har växt vid höga relativa luftfuktigheter är mycket möra. De måste tittas mycket noga på när de flyttas till växthuset för att se till att de acklimatiseras ordentligt.

Utrustning som används för vävnadsodling:

Förökning med vävnadskultur kräver ett antal laboratorieutrustning. De olika utrustningarna och deras funktioner är;

Autoklav: Sterilisering av alla glasapparater och odlingsmedier kan åstadkommas med hjälp av ånga som genereras i autoklaven.

Analytiska eller toppansaldon: För noggrann mätning av olika beståndsdelar i odlingsmedier, dessa saldon skulle krävas. Den övre pannbalansen används för att mäta större kvantiteter, medan den analytiska balansen används för att mäta mindre kvantiteter.

PH-mätare: Den används för att mäta och justera vätejonkoncentrationen i odlingsmediet eller lösningen. Vätejonkoncentrationen vill bibehållas exakt för att uppnå optimal tillväxt av växter.

Laminära luftflödesskåp: I dessa skåp separeras skott som utvecklats på explantat från kluster och överförs till färskt medium under sterilt tillstånd.

Destillationsset: Vatten som ska användas för framställning av odlingsmedier måste vara fritt från alla föroreningar och salter.

Luftkonditionering med stabilisatorer: Upprätthålla föredragen temperatur i växtrummet, inokuleringsrum eller kulturöverföringsrum skulle vara möjligt med luftkonditionering av dessa områden.

Mikroskop: a) Stereomikroskop:Detta skulle göra det möjligt att dissekera ut meristem av liten storlek från skottspetsar genom att ta bort skyddshöljena på bladprimordia.

1. b) Sammansatt mikroskop:Detta möjliggör detektering av bakterier och svampar i kultur- och växtvävnader.

Flasktvättenhet: Eftersom ett stort antal flaskor eller kärl i vilka växter kommer att utvecklas måste tvättas upprepade gånger före användning, en automatisk flasktvättsenhet skulle vara till hjälp.

Brickor: Stödstruktur för odlingsflaskor eller kärl.

Luckor: Passera genom lådor som används som en port mellan rent område och halvrent område för utbyte av material.

Dissekeringssatser: Dessa är nödvändiga för separering av skott och beredning av mikrosticklingar.

Användning av växtvävnadskultur:

Växtvävnadskultur används för att öka tusentals genetiskt identiska växter från en enda förälderväxt som kallas soma-kloner. Eftersom denna mikroförökningsprocess ger upphov till tusentals nya plantor, det har använts flitigt för tillverkning av kommersiellt viktiga växter inklusive matväxter som tomat , banan , och äpple , etc. Ett exempel på tillämpningen av mikroförökning observerades vid odling av orkidéer eftersom den steg exponentiellt på grund av tillgängligheten för miljontals plantor tack vare vävnadsodlingsmetoder. Varför är växtvävnadsodling viktig? I denna kultur, odlingsmediet eller odlingslösningen är mycket viktigt eftersom det används för stigande växtvävnad eftersom det innehåller olika växtnäringsämnen i form av "gelé" som kallas agar och växthormoner som är nödvändiga för växternas tillväxt.

Krav för växtvävnadskultur:

Omfattning och utbildning av växtvävnadskultur, det hänvisas till in vitro-odling av växter, frön och olika delar av växterna (organ, embryon, vävnader, enstaka celler, och protoplaster).

Växtvävnadsodling är ett av de snabbast växande områdena inom bioteknik på grund av dess höga potential att utveckla förbättrade grödor och prydnadsväxter. Med de framsteg som gjorts inom vävnadskulturen, teknologi, det är nu troligt att arter av vilken växt som helst i laboratoriet kan regenereras. För att få målet att skapa en ny växt eller en växt med önskade egenskaper, vävnadsodling är ofta kopplad med rekombinant DNA-teknik. Teknikerna för växtvävnadsodling har till stor del hjälpt till i den gröna revolutionen genom att förbättra skördens avkastning och kvalitet. Informationen som erhållits från växtvävnadskulturer har bidragit till vår förståelse av metabolism, tillväxt, differentiering och morfogenes av växtceller. På grund av det breda utbudet av applikationer, växtvävnadskultur lockar uppmärksamhet från molekylärbiologer, växtförädlare och industrimän. Vem introducerade växtvävnadskultur? På 1800-talet, idén att experimentera med vävnader och växtorgan under kontrollerade laboratorieförhållanden föddes. För första gången 1902, en tysk fysiolog, Gottlieb Haberlandt, utvecklade teorin om cellodling in vitro.

I linje med tekniken och målet för förökning av vävnadskultur, olika faciliteter kan också krävas nedan;

Landa: Det krävs att man inrättar ett laboratorium, moderväxtenhet, växthus &kontor. Utrymme kan krävas för installation av rörbrunn eller grävd brunn och parkering av fordon.

Moderväxter: Moderväxter skulle ge en källa till vävnader. Deras prestanda måste testas före användning, som en källa till explantat. I händelse av anslutning till väletablerade laboratorier, explantat från testande moderplantor kan vara tillgängliga utan kostnad. Annat, samling, underhåll och testning av överlägsna moderplantor skulle vara nödvändigt.

Laboratorium: Ett vävnadsodlingslaboratorium består normalt av mediaberedningsrum, medialagringsrum, inokuleringsrum, kulturöverföringsrum, tvättplats, etc. Planlösningen måste utformas för att främja maximal effektivitet. Designen måste underlätta upprätthållande av optimal temperatur, fuktighet, belysning &ventilation. Korrekt design av ett laboratorium kommer inte bara att minska kontamineringen utan även uppnå hög effektivitet i arbetsprestanda. Rätt planerade och designade laboratorier kan minska både drifts- och energikostnaderna.

Växthus i vävnadskultur: Vid förökning av vävnadskultur, ett växthus kan krävas för att föda upp och underhålla moderväxter så att tillväxten av organ som är lämpliga för vävnadsodling är maximal, särskilt när det gäller prydnadsväxter och för att härda plantorna regelbundet i en naturlig miljö. Växthuset kommer att möjliggöra kontroll över ljusintensitet och luftfuktighet, som är avgörande för härdning av växter.

Elektricitet: Som framgår av de föregående styckena, inget vävnadsodlingslaboratorium kan fungera utan elektricitet. Elektricitet är viktigt för att ge den erforderliga ljusintensiteten till de växande vävnaderna och skotten medan de är i laboratoriet, att driva olika utrustning och faciliteter, som inkluderar luftkonditionering.

Vatten: Vatten för att odla moderplantor, härdning av plantor, matsal, toaletter, etc. Destillerat vatten krävs för beredning av odlingsmedier och reagenser.

Råmaterial: Råvaror som krävs för vävnadskulturprojektet, förutom explantation, är olika beståndsdelar i kulturmedier.

Skicklig arbetskraft: Växtvävnadsodling är en mycket kvalificerad operation. Det skulle, därför, vara nödvändigt att laboratorie- och växthusarbetare är väl kvalificerade och erfarna inom tekniken. Deras utbildning i väletablerade kommersiella laboratorier skulle vara användbar.

Växtvävnadsodlingsstadier:

Vilka växter odlas med vävnadsodling? De nya plantorna kan sedan placeras i jord &odlas på vanligt sätt. Många typer av växter är lämpliga för användning i klassrummet. Blomkål , rossticklingar, Afrikanska violblad &nejlika stjälkar kommer alla lätt att producera kloner genom vävnadskultur.

Beredning av näringsmedium

Ett halvfast medium framställs i dubbeldestillerat vatten som innehåller makroelement, mikroelement, aminosyror, vitaminer, järnkälla, kolkälla som sackaros och fytohormoner. Mediet upphettas för att lösa agarn och 25 ml till 50 ml fördelas i varje flaska med bred mun. Kärlen som innehåller odlingsmedier förseglas sedan och steriliseras genom autoklavering.

Etablering av aseptisk kultur

Utgångsmaterialet för proceduren är i allmänhet en aktivt växande skottspets på hjälp- eller slutknopp eller skottspets på en växt. Proceduren för växtvävnadsodling startar från valet av moderväxter som har de önskade egenskaperna.

Ex-plant om möjligt den meristematiska vävnaden av den valda moderplantan isoleras. Den utskurna vävnaden/explantatet tvättas med vatten och sköljs sedan med ett desinfektionsmedel som savlon eller Dettol-lösning följt av en sterilvattentvätt. Vävnaden doppas sedan i 10 % bleklösning i tio minuter för att desinficera växtvävnadsmaterialet, dödar de flesta svamp- och bakterieorganismer. Steriliseringsprocedur för explantat beror på växtarter och typer av explantat

Ympning

Inokuleringsprocessen utförs under aseptiska förhållanden. I denna procedur överförs explantat eller mikroskott till det steriliserade näringsmediet.

Utveckling av växter i växtrummet

Efter inokulering av växtvävnaden, flaskorna försluts och överförs till tillväxtrummet för att utlösa en utvecklingsprocess under diffust ljus vid 23 till 27°C och 50 till 60 % relativ luftfuktighet. Ljus- och temperaturkraven varierar från art till art och ibland under utvecklingens olika stadier.

Kulturerna observeras dagligen för tillväxt och eventuella tecken på infektion eller kontaminering. kulturer, som inte visar utmärkt tillväxt eller infekterade, kasseras. De friska kulturerna utvecklas till små skottknoppar. Dessa subodlas på färskt medium efter fyra veckor. Antalet subkulturer som behövs är specifikt för växtarten, som är standardiserade. Skotten utvecklas i allmänhet efter fyra veckor. Efter att ett tillräckligt antal skott har utvecklats i varje behållare, till en minsta höjd av 2 cm överförs de till ett annat medium för att initiera rotningsproceduren. Beståndsdelen av rotstandarden för varje växtart är specifik. Rötter bildas vanligtvis inom två till fyra veckor. Växter i detta skede är ömtåliga och kräver noggrann hantering.

Härdning av mikroväxter

På grund av mycket hög luftfuktighet inuti odlingskärlet och konstgjorda utvecklingsförhållanden, plantorna är möra och är därför inte redo att klara av fältförhållandena. Växterna som tas bort från det sterila mediet tvättas och hålls under intermittent dimma eller täcks med ren transparent plast. Efter 10 till 15 dagar under hög luftfuktighet, växterna överförs till växthus och underhålls i ytterligare 4 till 6 veckor. De är sedan färdiga för att överföras till ett nytt hus eller åkern. I vanliga fall, växtvävnadsodlingsväxterna säljs antingen som ex-agarväxter eller härdade växter från växthuset.

Proceduren för växtvävnadsodling:

De delar av växten som används för odling kallas explantat. Explantaten odlas in vitro på ett näringsmedium som tillgodoser dess näringsbehov. Näringsmediet måste ge följande:-

1. Makronäringsämnen – Detta inkluderar element som kväve (N), fosfor (P), kalium (K), kalcium (Ca), svavel (S) som är nödvändigt för korrekt tillväxt och morfogenes.
2. Mikronäringsämnen - Element som järn (Fe), mangan (Mn), zink (Zn), etc., vilket är avgörande för tillväxten av vävnader.
3. Kol eller energikälla – Detta är en av de viktigaste ingredienserna i näringsmediet. Sackaros är den mycket använda kolkällan bland andra kolhydrater.
4. Vitaminer, aminosyror, &andra oorganiska salter.

Odlingsmediet fungerar också som ett medium för att tillhandahålla växttillväxtregulatorer till de problem som orsakar deras morfogenes enligt krav. Explantatens vävnader förlorar först sin specificitet för att bilda en hård brun klump som kallas callus. Callus delar sig sedan för att öka ett växtorgan eller en helt ny växt beroende på mängden och sammansättningen av fytohormoner som tillförs. Hela proceduren kräver att strikta aseptiska förhållanden alltid upprätthålls eftersom en enda kontaminering kan förstöra en hel sats av växter. Varför kallas vävnadsodling mikroförökning in vitro? Vävnadskultur är en förökningsmetod som används för att generera växter under sterila förhållanden. Det kallas in vitro mikroförökning, eftersom, explantaten odlas på medium &de genetiska resurserna bevaras i form av. Mikroförökade växter är fria från virus och visar ökad produktivitet och skörd.

Fördelar med växtvävnadskultur:

Massförökning av elitkloner: Mikroförökning möjliggör skapandet av ett stort antal växter från små bitar av moderväxten. Produktionen kräver måttligt korta tidsperioder för att odla växter. Beroende på arten som produceras, en ex-plant kan multipliceras till flera tusen plantor på mindre än ett år.

Växtförbättring genom vävnadsodling: Creation of superior varieties of agricultural crops is possible through plant tissue culture method, which otherwise is not possible during conventional plant breeding methods.

True to Type production: a Large number of true to the type plants can be propagated within a short time and space and that too throughout the year. Till exempel, it may be possible to propagate 2 to 4 lakhs of tissue cultured plants from a single bush or rose against 10 to 15 plants by conventional means. Också, it may take about 2 to 4 months to produce a healthy planting material by tissue culture means, whereas a minimum of 6 to 8 months is required for most species by the latest method of plant propagation.

Higher yields: Tissue Culture Plants may have increased branching &flowering, greater vigor and higher yield, mostly due to the possibility of elimination of diseases.

Beneficial when conventional propagation is difficult: The process may succeed to propagate plants where seeds or conventional propagation is not possible or undesirable.

Flexible method: The flexibility of nurseries can be better. As the capital investment on the mother plant is reduced to almost zero, it can be easier to adapt to changing conditions.

The innovation of new varieties: Plant tissue culture can be utilized for breeding new varieties.

Financial assistance in Tissue culture:

The tissue-culture export-oriented developments are eligible for refinance support by NABARD. Banks can provide loans for the activity provided the scheme is technically feasible &financially viable.

Bank Loan:

A bank loan of 75 to 80 % of the total cost of development shall be available from the financing institution. Bank loan considered in the model is 75%.

The rate of interest:

Banks are free to choose the rate of interest within the overall RBI guidelines issued from time to time. Dock, the final lending rate has been considered as 12% for working out the bankability of the model project.