av Kristin Hals och Sofia Helena Lindahl, Forsknings-och utvecklingsavdelning, Borregaard AS

Etoxikin har, i årtionden, använts i stor utsträckning som antioxidant i fodersektorn, främst inom marinindustrin.
Denna antioxidant hämmar oxidationen av mycket omättade fettsyror i fiskmjöl och fiskensilage. Etoxikin har den unika egenskapen att kunna lösas upp i både vatten- och oljefas, beroende på pH. Dock, det finns farhågor relaterade till användningen av denna antioxidant (se figur 1). I juni 2017, EU-kommissionen upphävde godkännandet av etoxikin för alla djurarter och djurkategorier. Därav, det finns ett behov av att hitta en alternativ lösning.
En ny alternativ produkt innehållande antioxidanten propylgallat har utvecklats av Borregaard. Denna produkt är optimerad för att säkerställa hög kvalitet, samt stabil produktprestanda. Den nya kombinationen av propylgallat, lignosulfonsyra och myrsyra utgör ett lönsamt alternativ för marknaden.

Introduktion
I juni 2017, EU-kommissionen upphävde godkännandet av etoxikin (se figur 1) för alla djurarter och djurkategorier [1]. Etoxikin har varit den valda antioxidanten i årtionden, speciellt inom fiskindustrin, för att förhindra härskning av fetter och oljor under bearbetning och lagring.
Borregaard har många års erfarenhet av att utvärdera effektiviteten av antioxidanter. Det finns flera olika metoder tillgängliga på marknaden för att testa antioxidantkapacitet [2-5] och DPPH-analysen [6] är en vanlig metod. På Borregaard, en egenutvecklad DPPH (2, 2-difenyl-1-picrylhydrazyl)-baserad metod – BAU*-metoden – används, som kommer att beskrivas senare i denna text.
*Borregaard Antioxidant Unit

Fiskensilage
Fiskensilage innehåller fisk, eller delar av fisk, kombinerat med en tillsats för att stabilisera ensilaget under lagring. Organiska syror av olika slag används vanligtvis som ensilagetillsatser. Under rätt förutsättningar, temperatur mellan 5 och 40 °C och vid pH mellan 3,5 och 4,5, fiskmassan kommer att börja brytas ned.
I denna process, kallas autolys, enzymer bryter ner musklerna, och en flytande massa bildas, vilket är önskvärt med tanke på dess enkla hantering genom pumpar, rör, etc. (Se figur 2). Marina lipider innehåller höga halter av långkedjiga fleromättade fettsyror (PUFA). PUFA oxideras lätt av syre, vilket resulterar i härskning av fetter och oljor och följaktligen minskad produktkvalitet. Fiskmjöl och fiskolja innehåller relativt höga koncentrationer av PUFA och är därför särskilt benägna att oxidera.
För att förhindra oxidation av PUFA i fiskmjöl och fiskolja, industrin använder för närvarande syntetiska antioxidanter som:etoxikin (E324), BHA (butylerad hydroxianisol, E-320) och BHT (butylerad hydroxitoluen, E321). Dessutom, naturliga antioxidanter som tokoferoler används också.

Screening av antioxidanter
Listan över godkända antioxidanter i foder är begränsad. I den här studien, flera antioxidanter, både syntetiska och naturliga, har utvärderats. Antioxidantkapaciteten testades med BAU-metoden.
BAU-metoden är en spektrofotometrisk metod, använder den stabila fria radikalen DPPH, att jämföra antioxidantkapaciteten hos lignosulfonater och antioxidanter. Förändringen i absorbans för en lösning innehållande DPPH och förening(er) av intresse mäts.
Oreagerad DPPH är violett, men efter reaktion, dvs överföring av fria radikaler till, till exempel, en antioxidant, lösningen ändrar färg till gul. Ju mindre antioxidant som behövs för att släcka DPPH-radikalen, desto starkare är antioxidanten.
Från visningen, BHA, propylgallat och askorbinsyra visade den högsta antioxidantkapaciteten. Baserat på ytterligare stabilitets- och löslighetsstudier, propylgallat (se figur 3) valdes för ytterligare testning.

Lignosulfonater och antioxidantkapacitet
Lignin är en naturlig polymer. Ordet "lignin" kommer från det latinska ordet "lignum", betyder trä. Lignin är det bindande elementet i trä och spelar en viktig roll i transporten av vatten, metaboliter och näringsämnen. Det fungerar som ett inkrustningsmaterial och utför flera funktioner som är avgörande för växtens liv.
Lignin ger styvhet till träcellväggarna och fungerar som ett bindemedel mellan cellväggarna, skapa ett kompositmaterial som är enastående motståndskraftigt mot kompression och böjning. Lignin är en av de mest förekommande organiska polymererna på jorden, överskrids endast av cellulosa.
Lignosulfonater är grenade, vattenlösliga biopolymerer framställda av lignin. Naturliga polymerer förstås som polymerer som är resultatet av en polymerisationsprocess som har ägt rum i naturen, oberoende av processen med vilken de har extraherats. De monomera enheterna som utgör den naturliga polymeren av lignin kan ses i (se figur 4).
Ligninbaserade produkter fungerar som tillsatser i flera industriella och kommersiella tillämpningar, och ersätter ofta petroleumbaserade produkter som en naturlig förnybar lösning. Bygger på inneboende kvaliteter, och ytterligare förstärkt av kemisk modifiering, våra ligninbaserade produkter erbjuder en unik och önskvärd uppsättning funktioner för den kemiska industrin inom områden som:betongtillsatser, dispergeringsmedel för bekämpningsmedel, batteriexpanderar, kemikalier för borrning av oljekällor, emulsioner, keramik, vägbindare, bypass protein och fodertillsatser.
Lignin är känt för att ha antioxidantegenskaper. Framförallt, vattenlösliga lignosulfonater har visat synergistisk effekt i kombination med antioxidanter. Polyfenoler används ofta som antioxidanter. På grund av den fenoliska molekylstrukturen hos lignosulfonater, associationer till antioxidanteffekt kan tillskrivas. I litteraturen, antioxidanteffekten av lignosulfonater i olika tillämpningar har rapporterats.
Lignosulfonater finns tillgängliga som lignosulfonsyrasalter. Figur 5 ger en illustration av lignosulfonsyran. Fenolgrupperna, och andra lätt oxiderade strukturer i lignosulfonsyran, kan fungera som asätare och stabilisera reaktiva och potentiellt skadliga fria radikaler.
2008, Borregaard lämnade in ett patent avseende användning av lignosulfonsyra som ett offer för antioxidanter. Patentet beskriver att de testade antioxidanterna bröts mindre ned i en organisk syralösning om lignosulfonsyra var närvarande, dvs. lignosulfonsyran fungerar som en offerantioxidant.

Stabilitet av propylgallat i organiska syror
En stabilitetsstudie av propylgallat i myrsyra (85%), och myrsyra (85%) innehållande 20% (vikt/vikt) lignosulfonsyra utfördes. Etoxikin inkluderades som referens.
Inklusionsnivån av antioxidanter i syrorna var 0,35 procent (vikt/vikt). 25-litersbehållare förvarades utomhus under sommaren och tidig höst. Antioxidanternas stabilitet testades regelbundet genom att mäta halten av antioxidanterna i proverna. Mätningarna gjordes med hjälp av högtrycksvätskekromatografi i kombination med UV-detektion (HPLC-UV).
Stabilitetsdata för propylgallat presenteras i figur 6a. De första mätningarna visade ett kvarvarande värde på 58 procent av det tillsatta propylgallatet i myrsyra. I lösningen som innehåller lignosulfonsyra, motsvarande värde var 90 procent (se figur 6a). Efter 75 dagar, motsvarande värden var 48 procent i myrsyra och 63 procent i lösningen innehållande lignosulfonsyra.
Resultaten visar tydligt att tillsats av lignosulfonsyra till lösningen stabiliserar och skyddar propylgallat bättre än lösningen som endast innehåller myrsyra. I figur 6b visas samma stabiliserande effekt av lignosulfonsyra för etoxikin.

Mätning av härskningsgrad
Som en kontroll av prestandan hos den nya antioxidanten i fiskensilage, härskningstester utfördes. Att mäta oxidation/härskningsgrad innebär testning av primära och sekundära nedbrytningsprodukter. Det vanligaste sättet är att mäta peroxidvärdet (PV), d.v.s. mätning av de primära oxidationsprodukterna (främst hydroperoxider), och för att mäta anisidinvärdet (AV), d.v.s. mätning av de sekundära oxidationsprodukterna.
Det sekundära steget av oxidation inträffar när hydroperoxider sönderdelas för att bilda karbonyler och andra föreningar som aldehyder. Det senare kommer att ge oljan en härsken lukt och mäts med AV.
Det är, därför, viktigt att mäta både PV och AV och utvärdera de två parametrarna tillsammans. Detta görs vanligtvis genom beräkning av det totala oxidationsvärdet, TOTOX, vilket ger en helhetsbild av oljans kvalitet; TOTOX =PV*2 + AV.

Fiskensilageförsök i labbskala
Propylgallat och lignosulfonsyrablandningar användes för att framställa fiskensilage. Lax hackades och maldes i en matberedare i laboratoriet. Olika syralösningar framställdes innehållande:

• 0,35 procent propylgallat i myrsyra 85 procent + lignosulfonsyra
• 0,70 procent propylgallat i myrsyra 85 procent + lignosulfonsyra
• 0,35 procent etoxikin i myrsyra 85 procent + lignosulfonsyra

Notera:Lösningarna innehöll framför allt 80 viktprocent myrsyra 85 procent och ~20 viktprocent lignosulfonsyra.
Fiskfärsen blandades med de olika sura lösningarna och förvarades i tvålitersbehållare i vattenbad vid 23°C. De sura lösningarna sattes till den hackade fisken för att nå det önskade pH-värdet på 3,5-3,6. Parallella prover gjordes.
Extraherade oljeprover från den hackade fisken samlades in vid olika tidsintervall under 11 veckor. Oljeproverna analyserades för härskningsprodukter, uttryckt som peroxid- och anisidinvärden. Surheten i fiskensilaget kontrollerades för att säkerställa pH <4.

Fiskensilagets stabilitet
TOTOX-värdena kan ses i figur 7. Varje TOTOX-värde beräknas från de uppmätta PV och AV i proverna. Efter sex veckor, ensilaget stabiliserats med propylgallat och lignosulfonsyra med samma TOTOX-nivå som ensilaget stabiliserat med etoxikin.
Dock, efter 11 veckor, ensilaget stabiliserat med propylgallat och lignosulfonsyra har lägre TOTOX-värden än ensilaget som innehåller etoxikin. Det fanns inga signifikanta skillnader mellan de två testade doserna av propylgallat.

Slutsats
Genom att kombinera data från lagrings- och fiskstabilitetsförsöken är det tydligt att propylgallat kan ersätta etoxikin som antioxidant i ensilagetillsatser.
Borregaard har utvecklat en ny ensilagetillsats innehållande myrsyra/lignosulfonsyra och propylgallat för fiskbiproduktindustrin. Denna produkt erbjuder följande fördelar:

• Etoxikinfri lösning
• Minskad nedbrytning av antioxidanten
• Längre hållbarhet för ensilagetillsatsen
• Stabilt och högkvalitativt fiskensilage

Bekräftelse
Arbetet som beskrivs finansierades av BioBased Industries Joint Undertaking under Horizon 2020 European Union Funding for Research and Innovation-programmen inom BioForEver-projektet (BIO-baserade produkter från FORestry via Economically Viable European Routes, bidragsavtal nr 720710).