Det subtilisinliknande proteinaset (AprBp) av Bacillus pumilus 3-19 är en lovande kandidat för industriell användning som fodertillsats. Dock, för att få ett högt utbyte av enzymet, det är nödvändigt att utveckla ett mycket effektivt uttryckssystem.
Syftet med studien var att få ett stabilt uttryck av B. pumilus 3-19 proteasgenen i Pichia pastoris expressionssystem och att utvärdera korrelationen av enzymaktivitet med valet av vektortyp och signalpeptider. I den här studien, för det stabila uttrycket av den optimerade proteasgenen i metylotrofa jästceller, vektorerna pPINK-HC och pPINK-LC selekterades. För extracellulär utsöndring av rekombinant proteas, en uppsättning effektiva signalpeptider användes. Försekvensen av a-parningsfaktorn har upprepade gånger lett till en ökning av utsöndringen av rekombinanta proteiner. Å andra sidan, sekvenserna av mördar- och lysozymsignalpeptider har inte tidigare använts för uttryck av bakteriellt proteas i P. pastoris.
Kolonier av transformanter med konstruktioner baserade på pPINK-LC-vektorn detekterades på den tredje inkubationsdagen och visade högre transformationseffektivitet än för kolonier med konstruktioner baserade på pPINK-HC-vektorn, som upptäcktes först på den 7:e inkubationsdagen. Transformationseffektiviteten på den 10:e inkubationsdagen för strukturer baserade på pPINK-LC-vektorn var i genomsnitt 1,3×103 transformanter/μg DNA, medan 1,03 × 103 transformant/μg DNA registrerades för konstruktioner med pPINK-HC-vektorn. Koloni-PCR visade att alla utvalda transformantkolonier innehöll den subtilisinliknande proteasgenen integrerad i jästgenomet.
Studien visade att inkubationstiden påverkar syntesen av proteas i P. pastoris, och den maximala aktiviteten av enzymet observerades. Jäststammar med konstruktioner baserade på lågkopieringsvektorn pPINK-LC visade högre proteasaktivitet (U/ml) vid hydrolys av azokasein (2,63 ± 0,16 för mördarsignalpeptid (SP), 2,49 ± 0,08 för α-parningsfaktorprekvens, 2,19 ± 0,11 för lysozym SP) än stammar med konstruktioner baserade på pPINK-HC-vektorn (1,86 ± 0,09 för mördar-SP, 2,21 ± 0,07 för α-parningsfaktorprekvens, 1,31 ± 0,11 för lysozym SP), oavsett vilken signalpeptid som användes. Den maximala proteasaktiviteten erhölls för jäststammar med pPINK-LC-killer-aprBp (5,75±0,08 U/ml) och pPINK-LC-a-mat.factor-aprBp (4,33±0,07 U/ml) konstruktioner.
Denna studie visade att det subtilisinliknande proteaset från rekombinanta P. pastoris-stammar uppvisar proteolytisk aktivitet, vilket beror på inkubationstiden och valet av signalpeptid och vektor. Produktionen av bacillärt proteas genom det heterologa jästbaserade expressionssystemet gör detta system lovande för utvecklingen av nya fodertillsatser för djurhållning.
Proteaser rankas bland de tre största grupperna av industriella enzymer och står för cirka 60 % av den totala globala försäljningen av enzymer, 40% av dessa tillhör bakteriella proteaser. Bakteriella serinproteaser har bred substratspecificitet, och hög motståndskraft mot olika förhållanden, som motiverar deras användning inom bioteknik, särskilt som biotillsatser för lantbruksfåglar och djur. Dessutom, Att komplettera foder med proteaser förbättrar absorptionen av aminosyror hos djur och sparar pengar för inköp av syntetiska aminosyror. Det har också visat sig att användningen av proteaser som fodertillsatser ökar biotillgängligheten av kväve, vilket i sin tur minskar halterna av ammoniakföroreningar i marken. Också, proteaser underlättar verkan av andra enzymer och ökar kostnadseffektiviteten hos foder, samt främja tillväxten av fördelaktig mikroflora i tarmarna hos slaktkycklingar.
I dag, ett begränsat antal kommersiella proteaser från utländska tillverkare används i Ryssland. De viktigaste representanterna på den ryska marknaden är de importerade fodertillsatserna CIBENZA DP100 (NOVUS (88,1%), USA), RONOZYME® ProAct (DSM (9,4%), Schweiz), Axtra® PRO TPT (DuPont (2,4%), Tyskland). Den erhållna rekombinanten omfattar P. pastoris-stammar med subtilisin-liknande bacillär proteas (aprBp) gen och tre olika signalpeptider (a-parningsfaktor, mördarprotein och lysozym). Ytterligare uttryck och rening av proteaset från jästkulturvätska och studiet av dess biokemiska och enzymatiska egenskaper kommer att hjälpa till att bedöma de biotekniska utsikterna för det rekombinanta enzymet.
Läs mer om studien, Heterologt uttryck av Bacillus pumilus 3–19 proteas i Pichia pastoris och dess potentiella användning som fodertillsats i fjäderfäuppfödning
