av Farshad Shishehchian, KritKhemayan, Zahra Javidi, Blue Aqua International Group of Companies, Thailand
Vattenbruket med räkor har påverkats dramatiskt av många patogena sjukdomar, främst orsakad av V. parahaemolyticus och White Spot Syndrome Virus (WSSV). Syftet med denna studie var att utvärdera den potentiella användningen av två funktionella fodertillsatser av AlphaGuard*L Plus (Liquid) och AlphaGuard*P (Powder) som består av eteriska oljor (eukalyptus, timjan, oregano som tillhör familjen Myrtaceae respektive Lamiaceae), Medium Chain Triglycerides (MCTs) och naturliga bioaktiva föreningar i räkor mot sjukdomsorsakade patogener, speciellt V. parahaemolyticus och WSSV.
Resultaten visade att AlphaGuard*L Plus effektivt fördröjde sjukdomsutvecklingen hos räkor. Dessa resultat tyder på att den funktionella fodertillsatsen av AlphaGuard*P och AlphaGuard*LPLUS skulle kunna användas för att främja räkors försvar mot patogener.
Introduktion
Utövandet av intensifiering av vattenbruket hämmas av hälsa och näring som påverkar tillväxtprestanda. För att reda ut dessa konsekvenser, Funktionella fodertillsatser har använts för att stimulera räkors immunförsvar och förbättra räkors prestanda, speciellt för att kontrollera virus- och bakteriepatogener vid nyligen behandlade räkorsjukdomar som V. parahaemolyticus som orsakade akut hepatopankreatisk nekrossjukdom (AHPND) och White Spot Syndrome Virus (WSSV) som orsakade White Spot Syndrome Virus (WSSV) Sjukdom (WSD), kombinerat med genomförandet av biosäkerhetsåtgärder.
Sammansättningen av AlphaGuard som består av MCT och eterisk olja erkänns som GRAS-praxis. I den här studien, effektiviteten hos AlphaGuard-produkten erhölls genom en kombination av data från diskdiffusionstestresultat, sjukdomsutmaningar och histologi, tillsammans med en utvärdering av AlphaGuard-produktens effekter på räksjukdomarna.
Material och metoder
Patogena bakterier och virus
Två virulenta patogener i räkor, V. parahaemolyticus och V. harveyi i glycerolstam, har sub-odlats i Tryptic Soy Broth (TSB) + en procent NaCl, inkuberas vid 37oC i 24 timmar, innan den ströks ut på tiosulfat-citrat-gallsalter-sackarosagar för att erhålla dess rena kultur.
WSSV-suspension framställdes från muskeln från WSSV-infekterade räkor. I korthet, den WSSV-innehållande räkmuskeln avlägsnades från lagring vid -80°C och skars i enhetliga bitar under kalla sterila förhållanden och homogeniserades sedan i TN-buffert (20 mM Tris-HCl, 400 mMNaCl, pH 7,4) vid 0,1 g/ml.
Efter centrifugering vid 2, 000 rpm i 10 minuter vid 4°C, supernatanten späddes till 1:100 med 0,9 procent NaCl och filtrerades genom 0,45 mikron. Den resulterande supernatanten förvarades vid -80°C, tills den användes som en källa för WSSV-injektion för utmaningsexperimenten.
Den antimikrobiella aktiviteten
Diskdiffusionstest
5 µl av AlphaGuard*L Plus och AlphaGuard*P, koncentration från 0, 0,25, 0,5, 1,0 och 10 procent utspädning med NaCl 0,85 procent, absorberades i fem millimeters diameter, 0,9 mm tjocka pappersskivor lufttorkades sedan innan de placerades i 105 celler av bakteriekultur i en petriskål 100 x 15 mm bred. 0,85 procent NaCl-lösning användes som negativ kontroll. Tre replikatplattor för varje behandling användes och observationer registrerades efter 24 timmar.
Artificiell infektion med V. parahaemolyticus och bestämning av antalet Vibrio i räkor hemolymfa (HL) och hepatopancreas (HP)
V. parahaemolyticus reaktiverades från lagring vid -80°C och odlades i TSB + en procent NaCl vid 37°C över natten. Kulturen centrifugerades vid 5, 000 rpm i 10 minuter, för att ta bort supernatanten, och pelleten återsuspenderades i steril 0,85 procent NaCl till en densitet av 8,4 x 106 CFU/ml.
Räkan, den femte veckan, infekterades genom att injicera 100 μL av bakteriesuspensionen i det andra buksegmentet av friska räkor vid femte odlingsveckan och dödligheten registrerades under sju dagar.
Räkor samlades in slumpmässigt den tredje dagen efter infektion för varje behandling och tvättades tre gånger med sterilt vatten. HL drogs ut från perikardhålan med hjälp av en steril engångsspruta på 1 ml under sterila förhållanden och sattes till en lika stor volym sterilt antikoagulant (tillsats av 10 mM EDTA-Na2 till 450 mMNaCl, 10 mMKCl, 10 mM HEPES, pH 7,3, 850 mOsm.kg-1 eller 10 mM Tris-HCl, 250 mM sackaros, 100 mM natriumcitrat, pH 7,6).
HL och mald HP serieutspäddes 10 gånger med kall steril PBS. Varje spädning spreds på TCBS-agarplattor placerade upp och ner i en 37°C inkubator och odlades i 16–20 timmar. Plattor innehållande 30–300 bakteriekolonier räknades, sedan registrerades siffrorna som CFU/ml eller CFU/g.
Konstgjord infektion med WSSV
ml av filtratet injicerades intramuskulärt i friska räkor vid den femte odlingsveckan. Räkor samlades in slumpmässigt sex timmar efter infektion för histopatologisk undersökning och dödlighet f registrerades under sju dagar.
Räkors tillväxtförhållanden och experimentella grupper
Räkor köptes från lokala thailändska gårdar. De testades negativt för V. parahaemolyticus-orsakad AHNPD och WSSV genom PCR-analys. Efter att ha acklimatiserat sig i en vecka i ett akvarium, innan experimentet, till synes friska räkor med enhetlig kroppslängd delades slumpmässigt in i tre grupper med sex replikat per grupp, 20 räkor per replikat.
Akvariets kapacitet var 100 liter, innehållande 60 liter havsvatten. Egenskapen för saltvatten bibehölls vid 15 ppt, pH 7,7-8,0 och DO>4,0 mg/L. Varje behandling innehåller juvenila räkor med en genomsnittlig startvikt på 2,6 g slumpmässigt lagrade i varje tank.
Räkor matades till mättnad upp till cirka 2,5-3 procent av sin kroppsvikt, tre gånger om dagen i fem veckor. Utfodringen justerades dagligen, enligt deras intagshastighet, för att säkerställa att fodret var helt förbrukat. Innan matning, molter, avföring, och döda räkor togs bort, 20 procent av vattnet i varje tank byttes ut var tredje dag med nytt havsvatten.
Experimentella dieter och datainsamling
Alla grupper hölls, under experimentet, under samma förhållanden som acklimatisering. Kontrollgruppen matades med kommersiella räkpellets, belagd med en procent kitin-kitosan. Behandlingsgrupper matades med AlphaGuard*L Plus sprayad på eller AlphaGuard*P, blandas med kommersiella räkpellets och belagda med en procent kitin-chitosan, vid dosering 5,0 ml eller g/kg foder. Parametrar för dödlighet och vattenkvalitet registrerades dagligen. I slutet av rättegången, överlevnadsgraden utvärderades.
Statistisk analys
Statistisk analys experimentella enheter, tankar, och akvarier fördelades på ett helt randomiserat sätt. Kvantitativa data kontrollerades för normalitet och homoskedasticitet. Data analyserades med envägsvariansanalys (ANOVA) för att söka efter signifikanta (p <0,05) skillnader mellan behandlingsmedelvärden.
Resultat
Den antibakteriella aktiviteten genom diskdiffusionsmetoder och inkludering i räkdieten på sjukdomsresistens av AlphaGuard*L Plus eller AlphaGuard*P
Diskdiffusionstest
Koncentrationerna av AlphaGuard*L Plus och AlphaGuard*P minst en procent hämmar både V. harveyi och V. parahaemolyticus, dock, det fanns högre hämningseffekt för V. parahaemolyticus jämfört med V. harveyi. Den effektiva koncentrationen av AlphaGuard kan ha sänkts om vi spädde ut i lipidlösliga ämnen, som etanol, för provning.
Eteriska oljekompositioner, analystekniker och verkningssätt har granskats intensivt. Denna studie undersökte inte molekylära detaljer för dess mekanismer, dock, den huvudsakliga effekten av bakteriedödande egenskaper kan vara relaterad till deras interferens av membranintegritet och permeabilitet som den lipofila föreningen från eterisk olja och MCT.
Olika fettsyror i MCT har olika lägsta hämmande koncentration (MIC), beroende på typen av fettsyra, mikroorganism, och miljöns pH. Den synergistiska och antagonistiska aspekten mellan ingredienser i AlphaGuard är inte klarlagd i denna studie. Den eteriska oljan i AlphaGuard fungerar också som en antioxidant för att förhindra eller bromsa oxidation av omättade MCT för att förlänga dess hållbarhet förutom att motverka stress i räkor.
V. parahaemolyticus utmaningstest
I slutet av foderförsöksexperimentet, räkor utmanades av V. parahaemolyticus. Kumulativ dödlighet plottades ut (se figur två). Resultaten av dödligheten, efter V. parahaemolyticus-utmaningen under ett sjudagarsintervall, visade att grupper av räkor som matades av AlphaGuard*P och AlphaGuard*L Plus hade signifikant lägre dödlighet än jämfört med kontrollgruppen efter dag fyra av infektionen.
Både AlphaGuard*P och AlphaGuard*L Plus hade samma statistiska dödlighet efter dag fem av infektion. I slutet av experimentet, i kontrast, överlevnaden var inte statistiskt korrelerad till dödligheten för AlphaGuard*P, (se figur tre).
Förmågan hos räkorröjning från Vibrio spp. efter tre dagars infektion plottades, (se figur fyra). Resultaten indikerade att Vibriospp. Antalet hemolymfa hos räkor som matades av AlphaGuard*P och AlphaGuard*LPlus var lägre än de kontrollerade grupperna. Räkornas förmåga att försvara sig mot bakterier i HP, matas av AlphaGuard*LPlus, hade också en mycket bättre förmåga att försvara än räkor som inte matades med AlphaGuard.
WSSV utmaningstest
WSSV provokationstest utfördes efter fem veckor av utfodringsförsöket. Den kumulativa dödligheten plottades, (se figur fem). Gruppen räkor som matades av AlphaGuard*L Plus visade betydande försening i dödligheten, jämfört med grupperna av kontroll och AlphaGuard*P-matade räkor under deras andra, tredje och fjärde dagen, (se figur sex).
Detta sammanfaller med inga histopatologiska tecken på H&E-färgning av WSSV-infektionsvävnad vid injektionsområdet, förutom generaliseringen av muskelnekros som sannolikt är relaterad till räkors försvarsmekanism efter tre dagars infektion. Ändå, alla grupper hamnade på 100 procent dödlighet.
Slutsats
Resultaten av detta försök antydde att appliceringen av AlphaGuard*P och AlphaGuard*L Plus fodertillsats i 0,5 procent med kommersiellt foder bevisade effektiviteten när det gäller att främja räkors försvar mot patogener. AlphaGuard*L Plus visade särskilt bättre prestanda.
